Resultaten laboratorium onderzoek

Resultaten onderzoek tijdvak januari – juli 2018

Vorderingen Laboratorium onderzoek VUmc:

  • In het eerste deel van 2018 zijn wij druk bezig geweest een aantal projecten af te ronden, op te schrijven en te publiceren. Zo hebben wij een protocol gepubliceerd in MethodsX, waarin wij aangeven hoe DIPG cellen genetisch veranderd kunnen worden zodat ze bepaalde eiwitten tot expressie kunnen laten komen. Daarnaast hebben wij gewerkt aan een artikel over MELK (Maternal Embryonic Leucine zipper Kinase), een eiwit dat hoog tot expressie komt in DIPG en gebruikt kan worden als aangrijpingspunt voor therapie (zie ook eerdere voortgangsrapportages hieronder). Op verzoek van reviewers hebben wij extra experimenten gedaan voor het ‘MELK project’ voordat het geschikt was voor publicatie. Dit onderzoek is nu echter afgerond en wordt binnenkort gepubliceerd in het gerenommeerde internationale vakblad Clinical Cancer Research. Wij hopen dat deze publicatie onze internationale collega’s en farmaceutische bedrijven motiveert om nieuwe medicijnen tegen MELK te ontwikkelen, omdat wij laten zien dat het middel dat wij hebben gebruikt (OTSSP167) weliswaar tumorgroei vertraagt en de overleving van muizen met DIPG verlengt, maar niet goed over de bloed-hersen barrière komt. Lees hier het interview met Hans Meel over de publicatie over dit onderzoek in Clinical Cancer Research.
  • Een ander geneesmiddel waar wij onderzoek aan gedaan hebben, naast OTSSP167, is Gemcitabine. Experimenten hebben aangetoond dat Gemcitabine mogelijk gebruikt kan worden in de behandeling van DIPG en in tegenstelling tot OTSSP167 wel over de bloed-hersen barrière komt. Vorig jaar hebben wij reeds gepubliceerd dat het gebruik van Gemcitabine in combinatie met bestraling in de kliniek veilig is voor kinderen met nieuw gediagnosticeerd DIPG (VUmc01 DIPG Fase A). In het laboratorium zien wij echter dat niet alle cellen van patiënten hetzelfde reageren op een behandeling met Gemcitabine. Door te onderzoeken wat er op moleculair niveau gebeurt na behandeling met Gemcitabine (via een techniek die RNA sequencing genoemd wordt), proberen wij nu te achterhalen waarom er verschil in respons kan zijn tussen cellen van verschillende patiënten.
  • Naast Gemcitabine en OTSSP167 is het afgelopen jaar tenslotte celastrol naar voren gekomen als mogelijk interessant middel voor de behandeling van DIPG. Dit is een natuurlijk plantenextract dat kan voorkomen dat DNA schade wordt gerepareerd door het remmen van het Fanconi D2 (FANCD2) eiwit. DIPG cellen hebben relatief veel FANCD2, dat de schade die we veroorzaken door bijvoorbeeld bestraling of behandeling met bepaalde chemotherapie (carboplatine) teniet doet. Door FANCD2 te remmen via celastrol kunnen cellen hun DNA schade niet meer herstellen en worden cellen in theorie dus gevoeliger voor chemotherapie. De combinatie celastrol/carboplatine lijkt in het laboratorium inderdaad zeer effectief en momenteel testen wij deze combinatie ook in onze diermodellen.
  • Voor al onze experimenten blijven wij diermodellen ontwikkelen, waarbij wij nu ook alternatieve manieren onderzoeken om nieuwe behandelingen voor DIPG uit te testen. Zo zijn wij een samenwerking aangegaan met dr. Timothy Phoenix van de universiteit van Cincinnati die mutaties in kan brengen in de hersenen van muizenembryo’s. Wanneer hij tijdens de ontwikkeling de Histon 3 mutatie aanbrengt, worden deze muizen geboren met een ponsglioom waaraan ze enkele weken na geboorte overlijden. Deze modellen worden geacht zeer representatief te zijn voor DIPG en stellen ons in staat om experimenten te doen die in onze eigen modellen niet mogelijk zijn, zoals studies van het immuunsysteem. In de komende tijd willen wij samen met Dr. Phoenix meer van deze modellen maken en onderzoeken of deze gebruikt kunnen worden voor het testen van immuuntherapie.

Resultaten onderzoek tijdvak augustus – januari 2018

Afgeronde projecten:
– Invloed kweekomstandigheden op onderzoeksresultaten
Lopende projecten:
– Ontwikkeling DIPG modellen
– Mesenchymale transitie in DIPG
– MELK inhibitie in DIPG

Algemeen en ontwikkeling modellen
Het afgelopen half jaar heeft in het teken gestaan van het afronden van projecten. Daarnaast blijven we preklinische modellen ontwikkelen en verbeteren voor het DIPG onderzoek. Dat heeft ertoe geleid dat we inmiddels enkele tientallen cellijnen hebben, waarvan een kleine twintig geschikt zijn voor proefdieronderzoek. Een deel van deze lijnen hebben we specifiek geoptimaliseerd voor het bestuderen van behandelingen in muizen, door ze uit te rusten met Luciferase, een gen uit het vuurvliegje dat ervoor zorgt dat tumorcellen licht geven. Op deze manier kunnen we de groei van de tumoren, en daarmee het effect van behandelingen, monitoren tijdens het leven van de muis. Op verzoek van onze internationale collega’s hebben we de methode waarmee we onze tumorcellen uitrusten met ‘vreemde’ genen opgeschreven, aangezien dit nog maar weinig onderzoeksgroepen lukt; ons protocol hiervoor zal binnenkort gepubliceerd worden.

Invloed kweekomstandigheden op onderzoeksresultaten
De afgelopen jaren hebben we uitgevonden dat de manier waarop laboratoria DIPG cellen kweken van grote invloed is op de onderzoeksresultaten, zoals de gevoeligheid voor medicatie. We hebben een deel van de mechanismen die hieraan ten grondslag liggen ontrafeld op zowel gen expressie als eiwit niveau, waarmee we laten zien hoe de kweekmethoden vals positieve en vals negatieve resultaten kunnen geven. De bevindingen van dit project zijn afgelopen September gepubliceerd in het internationale vakblad Experimental Cell Research, waar ze dienen als waarschuwing voor de internationale onderzoeksgemeenschap om altijd na te gaan of onderzoeksresultaten in het laboratorium niet zijn ontstaan door de gekozen kweekmethode.

MELK inhibitie in DIPG
Net als het hierboven beschreven project bevindt ook ons onderzoek naar de mogelijkheid om MELK inhibitie te gebruiken als een therapeutische strategie voor DIPG zich in de afrondende fase. Inmiddels hebben we in twee verschillende muismodellen – waaronder het door onszelf ontwikkelde VUMC-DIPG-F model, dat uniek is omdat het uit een biopt van een kind is ontstaan – bewezen dat behandeling met OTSSP167, een MELK inhibitor, de tumorgroei vertraagt en de overleving verlengt van muizen met DIPG. De behandelde muizen uit het laatste experiment zijn momenteel nog in leven, wat ons doet verwachten dat we binnen deze studie long term survivors hebben. Hoewel OTSSP167 zelf niet over de bloed-hersen barrière komt, en we de effectiviteit alleen kunnen bewijzen in muizen waarin deze barrière defect is, vormt dit wel een veelbelovend aanknopingspunt voor toekomstige therapieën. De resultaten van dit onderzoek zijn inmiddels verwerkt in een manuscript dat op korte termijn zal worden ingestuurd voor publicatie.

Resultaten onderzoek tijdvak januari-juli 2017

Net als in vorige jaren blijven we onderzoeksmodellen opzetten om nieuwe behandelingen op uit te testen. Ook in de eerste helft van 2017 zijn er op dit terrein vorderingen geboekt. Zo hebben we twee nieuwe cellijnen ontwikkeld uit biopsiemateriaal van DIPG patiënten. Deze lijnen zijn extra waardevol, omdat de patiënten waarvan het tumorweefsel afkomstig is ten tijde van biopsie nog geen behandelingen hadden ondergaan die de tumor mogelijk zouden kunnen veranderen. Eén van deze cellijnen, VUMC-DIPG-F, groeit in muizen bovendien veel sneller uit tot een tumor dan de modellen die wij tot nu toe tot onze beschikking hadden, wat het uittesten van nieuwe behandelingen vergemakkelijkt. VUMC-DIPG-F wordt momenteel gebruikt om de eerder beschreven effecten van OTSSP167, een remmer van MELK kinase (zie voortgangsrapportage 2016 hieronder), te bevestigen.

Naast de nieuwe DIPG modellen hebben we ook een muismodel ontwikkeld van een thalamusglioom, een sterk aan DIPG verwante tumor met dezelfde karakteristieke afwijking in het histon 3 gen die vaak in DIPG tumoren wordt gevonden.

Zoals hierboven aangegeven, hebben de meeste DIPG tumoren een mutatie in het DNA dat codeert voor het histon 3 gen. Histonen zijn eiwitten die een rol spelen bij de vouwing van ons DNA. Wanneer DNA strak rond histonen gewikkeld wordt, kan het niet afgelezen worden en is genexpressie niet mogelijk. Wanneer DNA echter uitgerold wordt, kunnen genen geactiveerd worden, wat resulteert in de vorming van RNA en eiwit. In een gezonde cel wordt het op- of uitrollen van DNA gereguleerd door een proces dat ‘epigenetica’ genoemd wordt. Daarbij worden bepaalde chemische groepen, zoals methyl- of acetylgroepen, aan histonen of aan DNA gekoppeld, waarbij methylering ervoor zorgt dat DNA dicht opeengepakt komt te zitten en acetylering ervoor zorgt dat DNA uitgerold wordt. Dit samenspel van methylatie en acetylatie zorgt voor een complex regulatiemechanisme dat genexpressie coördineert. In tegenstelling tot mutaties in het DNA zijn de epigenetische veranderingen omkeerbaar. De mutatie in het histon 3 gen die gevonden wordt in het DNA van meer dan 75% van de DIPG patiënten zorgt er echter voor dat de epigenetische regulatie verstoord is, waardoor de cellen zich anders gaan gedragen. In één van onze projecten proberen wij dit te herstellen door het gebruik van zogenaamde epigenetische middelen: medicijnen die effect hebben op de methylerings- of acetyleringsprocessen in een cel. Daartoe hebben wij in het laboratorium onderzocht wat het effect van ~250 verschillende epigenetische middelen is op celgroei en celoverleving. Daaruit bleek dat DIPG cellen vooral gevoelig zijn voor medicijnen uit bepaalde klassen: de zogenaamde HDAC (histon deacetylase) remmers, HAT (histon acetyltransferase) remmers en Bromo-domein remmers. Dergelijke experimenten zijn herhaald in combinatie met bestraling, of in combinatie met andere medicijnen om te onderzoeken dit het effect van deze epigenetische middelen kan versterken. De meest veelbelovende combinaties zullen de komende tijd verder worden onderzocht.

Naast het effect op celgroei, onderzoeken wij ook wat het effect is van epigenetische medicijnen op de methylering en acetylering van histonen. Dat doen wij door middel van Western blotting, een techniek om specifieke eiwitten zichtbaar te maken. Momenteel kijken wij of er bepaalde trends of profielen te vinden zijn in de methylering/acetylering van histonen die correleren met de gevoeligheid voor bepaalde middelen.

In veel van onze projecten testen wij het effect van medicijnen op DIPG cellen in het laboratorium. Daarbij kweken wij deze cellen onder verschillende omstandigheden; afhankelijk van de omstandigheden en factoren die wij toedienen groeien de cellen als hechtende laag (waarbij cellen aan de ondergrond ‘plakken’), of als ‘neurosferen’, waarbij de cellen een soort klontjes vormen die in het kweekmedium drijven. Wij verkiezen deze twee methodes, omdat wij denken dat cellen ook in de patiënt op deze twee manieren groeien. Verschillende onderzoeksgroepen in de wereld gebruiken echter meestal slechts één van beide kweekmethoden voor het uittesten van behandelingen.

In het afgelopen jaar hebben wij aan kunnen tonen dat de gevoeligheid van DIPG cellen voor bepaalde medicijnen een gevolg kan zijn van de manier waarop cellen gekweekt worden. Zo zien wij dat hechtende cellen gevoelig zijn voor het middel Dasatinib, maar dat dezelfde DIPG cellen volkomen ongevoelig zijn voor dit middel wanneer ze als neurosfeer groeien. Door te onderzoeken welke processen er in een cel veranderen onder invloed van de specifieke kweekmethoden, konden wij bovendien verklaren waardoor deze verschillen in gevoeligheid voor medicatie ontstaan. Dit is van groot belang voor het opstarten van klinische studies, aangezien de veronderstelde gevoeligheid van DIPG cellen dus een gevolg kan zijn van de kweekomstandigheden in het laboratorium die niet persé overeenkomt met de gevoeligheid van tumorcellen in patiënten. De resultaten van dit onderzoek zijn inmiddels opgestuurd naar wetenschappelijke bladen ter publicatie.

Naast de bovengenoemde experimenten, waarbij het effect van bepaalde middelen onder verschillende kweekomstandigheden wordt onderzocht, gebruiken wij ook diermodellen om een mogelijk nieuwe behandelingen van DIPG te testen. Daartoe rusten wij tumorcellen veelal uit met het zogenaamde ‘luciferase gen’. Wanneer cellen dit gen tot expressie brengen, ontstaat er een lichtsignaal waardoor tumorgroei – en dus ook het effect van behandelingen – makkelijk in de tijd gevolgd kan worden met behulp van een lichtgevoelige camera. Wij blijken één van de weinige laboratoria ter wereld die luciferase, of andere genen, in primaire DIPG cellen kunnen aanbrengen. Daarom zijn we deze techniek nu in detail aan het opschrijven, zodat dit via een publicatie ook door andere groepen gebruikt kan gaan worden.

  • Het artikel van Lot Sewing over het gebruik van CED voor het toedienen van doxorubicine in de hersenstam van muizen is gepubliceerd in het “Journal of Neurosurgery – Pediatrics”.
  • De contracten van Kenn Zwaan en Marcel de Winter zijn beëindigd; Lot Sewing heeft alle experimenten afgerond en goedkeuring gekregen voor haar promotie (gepland eind 2017). Dat betekent dat het team van Stichting Semmy in het laboratorium momenteel bestaat uit: Piotr Waranecki (research analist) en Hans Meel (promovendus), onder supervisie van Esther Hulleman. Daarnaast werkt Dennis Metselaar (promovendus) aan een iets breder project dat gefinancierd wordt door KiKa en dat naast DIPG ook andere hooggradige gliomen bij kinderen omvat.

Resultaten onderzoek 2016

Dankzij een anonieme gift heeft Stichting Semmy in het voorjaar van 2016 een drugprinter kunnen aanschaffen voor de laboratoriumexperimenten. Deze machine werkt als een inkjetprinter maar verdeelt in plaats van verschillende kleuren inkt (combinaties van) medicijnen uit, die door de gebruiker vooraf worden geprogrammeerd. Dankzij deze printer kunnen we in het laboratorium een groot aantal experimenten sneller en nauwkeuriger uitvoeren dan wanneer de medicijnen handmatig zouden worden gepipetteerd, zoals dat tot nu toe werd gedaan. Met behulp van deze drugprinter onderzoeken wij momenteel het effect van verschillende medicijncombinaties op DIPG cellen uit, al dan niet in combinatie met bestraling.

Mede door internationale uitwisseling hebben wij ondertussen celkweken tot onze beschikking van 15 DIPG patiënten, waarvan er maar liefst 6 uit ons eigen onderzoek voortkomen. Deze cellen hebben verschillende genetische afwijkingen en eigenschappen. De meeste van deze celkweken hebben een afwijking in het histon 3 gen, dat in >75% van de patiënten voorkomt. Als enige laboratorium ter wereld zijn wij er echter ook in geslaagd om een DIPG cellijn zonder deze mutatie te laten groeien (VUmc-DIPG-10). Omdat veel studies het effect van de histon-afwijking onderzoeken (bijvoorbeeld voor het bepalen van medicijn-gevoeligheid) is het ook van belang te weten wat er gebeurt als cellen deze mutatie niet hebben en wij hebben ondertussen dan ook veel (internationale) verzoeken gekregen voor het gebruik van VUmc-DIPG-10 cellen.

VUmc-DIPG-10 blijkt ook geschikt te zijn voor het uittesten van behandelingen in muizen, aangezien deze cellen tumoren vormen na implantatie in het brein. Veel – maar niet alle – DIPG cellijnen vormen tumoren, maar om het effect van therapie te kunnen bepalen is het van belang dat we tumorgroei (en dus het effect van een behandeling) in de tijd kunnen meten. Om dat te kunnen doen rusten wij DIPG cellen uit met luciferase, een gen dat codeert voor het enzym waarmee vuurvliegjes licht produceren. Wanneer vervolgens luciferine wordt toegediend aan dieren waarin deze cellen geïmplanteerd zijn, zullen de tumorcellen licht geven, wat we kunnen meten met een lichtgevoelige camera. Een probleem met DIPG cellen is echter dat deze, in tegenstelling tot nagenoeg ieder ander type kanker, zeer moeilijk uit te rusten zijn met luciferase. Na meer dan een jaar optimaliseren zijn wij eindelijk, als enige onderzoeksgroep ter wereld, toe in staat dit succesvol uit te voeren. Het eerste model dat hierdoor bruikbaar is gemaakt voor behandelstudies in het HSJD-DIPG-07 model, tevens het snelst groeiende DIPG model in muizen. Twee andere DIPG lijnen, JHH-DIPG-01 en VUmc-DIPG-11 hebben wij ondertussen ook uitgerust met luciferase en hiervan onderzoeken wij momenteel de tumorgroei en –biologie in proefdieren om ze ook te kunnen gebruiken voor het uittesten van behandelingen.

Met veel geduld is het ons tenslotte ook gelukt om de VUmc-DIPG-08 cellen in muizen te laten groeien. Gezien de lange tijdsspanne tot tumorvorming (9-10 maanden na implantatie van de tumorcellen), is deze lijn voorlopig echter niet bruikbaar voor behandelstudies. We kweken de cellen die we uit de muizentumor hebben geïsoleerd momenteel wel weer op om ook deze met luciferase uit te rusten en te zien of ze bij een volgende injectie eventueel wat sneller aanslaan.

Eén van de medicijnen die centraal staat in onze behandelstudies is panobinostat, het middel dat wij vorig jaar hebben geïdentificeerd in een drugscreen en waar veel publicitaire belangstelling voor was. Zoals voorspeld lijkt een behandeling met panobinostat als monotherapie niet voldoende te zijn om patiënten te genezen, omdat tumorcellen na langdurige behandeling overschakelen op alternatieve overlevingsmechanismes. Met behulp van de drugprinter hebben we de interactie onderzocht tussen panobinostat en OTSSP167, een medicijn dat een eiwit remt dat MELK heet (Maternal Embryonic Leucine zipper Kinase). Combinatie van panobinostat en OTSSP167 lijkt een sterk celdodend effect te hebben en zou eventueel gebruikt kunnen worden als therapie. Om verder te onderzoeken wat het gevolg is van een behandeling met OTSSP167 op DIPG cellen hebben we bepaald welke genen er aan- of uit worden gezet wanneer cellen met dit middel worden behandeld, met behulp van een nieuwe techniek die ‘RNA sequencing’ wordt genoemd. Uit deze experimenten bleek dat MELK genexpressie in DIPG cellen reguleert via PPARγ, een transcriptiefactor die een rol speelt in gliomen bij volwassenen. Omdat er middelen beschikbaar zijn die de activiteit van PPARγ kunnen beïnvloeden en waarvan bekend is dat ze over de bloed-hersen-barrière komen, hebben we onderzocht of dergelijke medicijnen het effect van OTSSP167 kunnen versterken. Dit leek in veel van onze DIPG cellijnen inderdaad te gebeuren. Echter, toen wij onderzochten of OTSSP167 ook over de bloed-hersen-barrière kon komen, bleek dat niet het geval te zijn, doordat er daar bepaalde eiwitten voorkomen die OTSSP167 wegpompen. Omdat wij denken dat het remmen van MELK activiteit toch een groot effect kan hebben op tumorgroei, willen wij de effectiviteit van OTSSP167 onderzoeken in muizen die deze pomp-eiwitten niet bezitten. Mochten hier goede resultaten uitkomen, biedt dat aanknopingspunten om verder te zoeken naar andere middelen die MELK remmen en wel over de bloed-hersen-barrière komen als alternatief voor OTSSP167.

Om het probleem van de bloed-hersen-barrière te omzeilen, hebben we in de afgelopen jaren alternatieve toedieningsmethodes onderzocht, zoals ‘convection enhanced delivery’ (CED). Bij CED worden middelen direct in de tumor in de hersenstam gespoten. Hoewel dit goed bleek te werken voor toediening van carmustine in muizen, bleken we voor andere middelen soms niet de benodigde concentraties te bereiken die nodig zijn om tumorgroei effectief te remmen. Om hier een alternatief voor te vinden zijn we een samenwerking aangegaan met het Hospital San Juan de Deú (HSJD) in Barcelona. Dankzij een onderzoeksbeurs van het KNAW (Koninklijke Nederlandse Academie van Wetenschappen) heeft Lot Sewing daar een half jaar onderzoek gedaan naar het effect van het middel irinotecan op tumorgroei in ratten. Hierbij werd een medicijnpomp onder de huid aangebracht die zorgde voor een continue toediening van medicijn in de hersenstam, via CED. Om te onderzoeken hoe ziek de dieren waren (ten gevolge van de tumorgroei of behandeling), maakte zij vervolgens gebruik van een zogenaamde Rota Rod test. Hierbij moeten ratten over een ronddraaiend rad lopen totdat ze ervan af vallen; hoe zieker een rat, hoe eerder dat gebeurt. Uit deze experimenten bleek dat CED met lage concentraties irinotecan gedurende een langere periode veilig kon worden toegepast in de (gezonde) hersenstam. Eenzelfde procedure met hogere concentraties leidde tot toxiciteit en ernstige bijwerkingen. Momenteel wordt nog onderzocht wat het effect is van irinotecan op de groei van DIPG tumoren wanneer het via deze methode bij ratten wordt toegediend.

  • Vanaf 1 april 2016 zijn er zijn twee nieuwe medewerkers bij het onderzoek aangesteld: Marcel de Winter (dierexperimenteel analist) en Dennis Metselaar (promovendus).
  • Het artikel waarin we met behulp van PET (positronemissietomografie) onderzoeken of het medicijn Bevacizumab na toediening via de bloedbaan in hersenstamtumoren in muizen aankomt is geaccepteerd voor publicatie in Molecular Cancer Therapeutics.

In de tweede helft van 2016 hebben wij veel onderzoek gedaan naar een eiwit dat MELK genoemd wordt (Maternal Embryonic Leucine zipper Kinase). Eerdere experimenten toonden namelijk aan dat behandeling met OTSSP167, een medicijn dat de activiteit van MELK remt, DIPG cellen selectief kan doden. Verder onderzoek toonde echter ook aan dat dit medicijn niet over de bloed-hersen barrière komt en als zodanig in de praktijk dus niet gebruikt kan worden in de behandeling van patiënten met DIPG.

Om te bewijzen dat MELK een goed aangrijpingspunt is voor de behandeling van DIPG en anderen (bv farmaceutische bedrijven) te overtuigen een medicijn te maken tegen MELK dat wél over de bloed-hersen barrière komt, hebben we een zogenaamd ‘proof-of-principle’ experiment uitgevoerd. Hiervoor hebben wij muizen die bepaalde onderdelen (drugspompen) van de bloed-hersen barrière missen, uitgerust met DIPG tumoren en vervolgens behandeld met OTSSP167. Daarbij zagen wij dat bij sommige – maar niet alle – dieren de behandeling uitermate goed aansloeg. Direct na aanvang van de behandeling stopte de tumorgroei in deze dieren en dit effect hield ook aan nadat de behandeling gestopt werd. Andere muizen leken echter geen profijt te hebben van behandeling met OTSSP167, ondanks het feit dat deze dieren dezelfde pompen misten in de bloed-hersen barrière als de muizen die wel respons lieten zien. In de komende maanden zullen wij uitzoeken waar dit verschil mogelijk door veroorzaakt wordt.

Naast het uittesten van nieuwe behandelingen, zijn wij ook bezig met het opzetten van een diagnostische test, waarmee we bepaalde genetische afwijkingen van de tumor in bloed kunnen aantonen. Tumorcellen scheiden kleine blaasjes af (zogenaamde ‘exosomen’) die zowel eiwit als RNA (kopieën van delen van het DNA) uit de tumorcel bevatten. Bloedplaatjes – normaal verantwoordelijk voor de stolling van bloed – nemen de exosomen op en bevatten vervolgens dus ook kenmerken van de tumorcel. Door de bloedplaatjes vervolgens te analyseren, kunnen we informatie verkrijgen over de tumor, zonder dat daarvoor een biopt genomen hoeft te worden. Hierdoor zouden grote en moeilijke operaties dus minder vaak nodig zijn. Bovendien zouden we met deze methode kunnen volgen of een bepaalde behandeling al dan niet aanslaat; door op verschillende momenten bloedmonsters te nemen, kunnen we zien of het ‘tumor-signaal’ minder wordt of toeneemt.

Hoewel dit een zeer beloftevolle methode is, blijkt het tot nog toe erg moeilijk om betrouwbare resultaten te verkrijgen; wanneer we dit daadwerkelijk in de praktijk toe willen passen, moet een dergelijke techniek immers onfeilbaar zijn. De komende tijd zullen we derhalve proberen om deze methode te optimaliseren.

Tenslotte hebben we de laatste maanden veel tijd gestoken in het onderzoeken welke factoren betrokken kunnen zijn bij het ontstaan van DIPG. Het feit dat autopsiemateriaal – afkomstig van kinderen met een ponsglioom – tumoren kunnen veroorzaken in muizen (zie voortgangsrapportage Januari-Juli 2013) suggereert namelijk dat dit materiaal factoren bevat die een rol spelen in DIPG. Omdat eerder is aangetoond dat sommige virussen betrokken zouden kunnen zijn bij het tot stand komen van bepaalde soorten kanker in zowel kinderen als volwassenen, richtten wij ons daarbij voornamelijk op virussen. Momenteel analyseren wij daarom of er eiwitten of genetisch materiaal van virussen in DIPG tumor materiaal aanwezig is.

–     Vanaf 1 september 2016 is Kenn Zwaan aangesteld als analist in het laboratorium.

Resultaten onderzoek 2015

Afgelopen jaar was zeer succesvol voor het laboratoriumonderzoek, met als hoogtepunt de publicatie in het gerenommeerde tijdschrift Nature Medicine en de daardoor gegenereerde publiciteit in de Telegraaf en bij RTL late Night. Belangrijkste boodschap uit deze publicatie was dat het medicijn panobinostat in het laboratorium DIPG cellen kan doden in concentraties die ook in het lichaam behaald kunnen worden. DIPG cellen zijn van nature dus niet resistent tegen elke vorm van behandeling, zoals oorspronkelijk gedacht, maar kunnen wel degelijk uitgeroeid worden. De verwachting is echter dat een behandeling met panobinostat alleen niet voldoende zal zijn om patiënten te genezen, omdat tumorcellen na langdurige behandeling overschakelen op alternatieve overlevingsmechanismes. Bovendien blijft de bloed-hersen barrière, een natuurlijk beschermingsmechanisme dat ervoor zorgt dat de hersenen worden afgeschermd van schadelijke stoffen, een probleem; chemotherapie komt daardoor vaak niet in een voldoende hoge dosis aan in de hersenen om tumorgroei tegen te gaan. Ons onderzoek heeft zich afgelopen jaar derhalve gericht op het vinden van nieuwe (combinatie)therapieën en alternatieve vormen van toediening van deze medicijnen.

– In eerdere experimenten hebben we aangetoond dat het middel carmustine zonder schadelijke bijwerkingen via een methode genaamde ‘convection enhanced delivery’ (CED) direct in de hersenstam van muizen kan worden toegediend en dat dit middel tumorgroei remt. Nieuwe experimenten tonen echter aan dat dit niet voor alle chemotherapie geldt. Zo hebben we het medicijn doxorubicine, dat effectief bleek op DIPG cellen in het laboratorium, in twee verschillende vormen via CED in muizen toegediend: zogenaamd ‘vrij’ doxorubicine, of ditzelfde medicijn verpakt in vetbolletjes. Bovendien werd het op twee verschillende plaatsen ingebracht: in de hersenstam, of in de thalamus (een deel van de grote hersenen). Uit deze studie bleek dat de hersenstam veel gevoeliger is voor doxorubicine dan de thalamus en dat de dosis die nodig is voor behandeling van de tumor in de hersenstam zeer schadelijk is voor normaal hersenweefsel. Wanneer een lagere dosis wordt gebruikt, is dit niet voldoende effectief om tumorgroei te remmen. Dit medicijn lijkt bij deze manier van toediening dan ook niet geschikt voor de behandeling van DIPG. Wel zagen we dat doxorubicine een effect had op tumoren in de thalamus en dat de medicijnen die in vetbolletjes waren verpakt beter werkten dan het vrije doxorubicine.

– Aangezien de hersenstam zeer gevoelig bleek voor bepaalde middelen, zullen we andere medicatie moeten kiezen of de toediening van deze middelen moeten aanpassen. Hierbij kan gedacht worden aan CED met lagere concentraties medicijnen over langere tijd of in grotere volumes (zodat uiteindelijk dezelfde hoeveelheid medicijn wordt gegeven, maar met mogelijk minder schade). Om dergelijke alternatieven goed te onderzoeken, zijn we een samenwerking aangegaan met het Hospital San Joan de Déu (HSJD) in Barcelona, waar veel gewerkt wordt met DIPG ratmodellen. Aangezien ratten een grotere hersenstam hebben dan muizen, kunnen we omstandigheden voor CED makkelijker variëren en kunnen we  bijwerkingen eenvoudiger onderzoeken. Zo kan het effect van tumorgroei gemeten worden door neurologische functies te testen (vooral kracht en coördinatie van de onderste ledematen) middels een zogenaamd Rota-rod systeem, waarbij ratten met een ponsglioom over een ronddraaiend rad lopen totdat ze ervan af vallen. Ook kunnen we CED in ratten over een relatief lange periode toepassen, met behulp van een onder de huid geplaatste medicijnpomp. Om deze nieuwe onderzoekstechnieken te leren en die vervolgens ook bij VUmc te kunnen toepassen heeft Lot Sewing een onderzoeksbeurs gekregen van het KNAW (Koninklijke Nederlandse Academie van Wetenschappen).

– Niet alle medicatie hoeft via CED in de tumor te worden toegediend. Hoewel vaak minder efficiënt, kunnen sommige medicijnen namelijk wel de bloed-hersen barrière passeren. In samenwerking met collega’s aan het NKI (Nederlands Kanker Instituut) onderzoeken wij momenteel welke concentraties van bepaalde middelen de hersenen bereiken en of dat genoeg is om tumorcellen te doden. Een voorbeeld van een dergelijk middel is een medicijn dat een eiwit remt dat MELK heet. Dit eiwit is betrokken bij veel biologische processen die een rol spelen tijdens de embryonale ontwikkeling en in tumoren. In het laboratorium leidt het remmen van MELK activiteit al bij zeer lage medicijnconcentraties tot de dood van DIPG cellen. Wij verwachten binnenkort te weten of deze concentraties ook in het brein kunnen worden bereikt.

– Een ander medicijn dat volgens recente publicaties over volwassen hersentumoren in efficiënte concentraties over de bloed-hersen barrière lijkt te komen is het middel Marizomib. Dit is een nieuw soort chemotherapie dat effect heeft op de afbraak van ongewenste of overbodige eiwitten in cellen via remming van het zogenaamde ‘proteasoom’. Aangezien Marizomib in het laboratorium zeer effectief is tegen DIPG, zijn wij momenteel experimenten aan het voorbereiden om te testen of dit middel ook in diermodellen effectief is.

– In het afgelopen jaar hebben we de beschikking gekregen over een aanzienlijk aantal nieuwe DIPG modellen om behandelingen op te testen, waarvan we een aantal zelf hebben ontwikkeld. De laatste cellijn die wij zelf hebben gecreëerd (VUMC-DIPG-9) kan zowel groeien in het laboratorium als in muizen en is dus geschikt voor het uittesten van behandelingen. Bovendien kweken wij momenteel ook cellen van een andere patiënt, maar voordat we daar experimenten mee kunnen uitvoeren is het belangrijk te bevestigen dat de cellen die in het laboratorium groeien dezelfde karakteristieke eigenschappen hebben als de oorspronkelijke tumor.

– Een probleem bij het kweken van tumorcellen in het laboratorium is dat sommige patiëntencellen verschillende omstandigheden nodig hebben om goed te kunnen groeien. Zo gedijen bepaalde cellen goed wanneer zij in direct contact staan met andere cellen in een hechtende laag en groeien andere cellen beter wanneer ze als zogenaamde ‘neurosferen’ worden gekweekt: driedimensionale bolletjes van cellen die een soort mini-tumor vormen. Het blijkt echter dat wij de groeiwijze kunnen beïnvloeden door de omstandigheden te veranderen; in ons laboratorium proberen wij iedere cellijn dan ook op beide manieren te kweken. Uit deze experimenten hebben wij geleerd dat de kweekmethode een grote invloed heeft op de onderzoeksresultaten, zoals de gevoeligheid voor bepaalde medicijnen. In sommige gevallen is een cellijn die op de ene manier gekweekt is een factor 1000 gevoeliger voor een medicijn als dezelfde cellijn die op de andere wijze groeit. Momenteel proberen wij meer inzicht te krijgen in de achtergrond van deze verschillen, om een meer gefundeerde keuze te maken voor het gebruik van nieuwe medicijnen.

– Dankzij het voorwerk dat met de hulp van Stichting Semmy gedaan is, hebben wij recentelijk extra subsidies binnen gehaald die het DIPG onderzoek moeten versnellen. Belangrijkste toekenningen zijn:

  • een subsidie van KiKa om de rol van virussen in het ontstaan van DIPG te onderzoeken (1-jarig project);
  • een subsidie van KiKa om te onderzoeken of zogenaamde ‘epigenetische therapie’ als behandelmethode kan dienen voor hoog-gradige gliomen en DIPG bij kinderen.
  • een subsidie van de ‘Cure Starts Now Foundation’ om te onderzoeken of we bloedplaatjes kunnen gebruiken om tumorgroei te volgen en mutaties aan te tonen, zodat in de toekomst geen biopten meer genomen hoeven te worden.

 

Resultaten onderzoek, tijdvak augustus-december 2014

–       In samenwerking met buitenlandse partners hebben we ondertussen een flink aantal cellijnen beschikbaar voor het testen van nieuwe behandelingen. Eerder hadden we al cellen gekregen vanuit Johns Hopkins, San Francisco en Stanford (USA) en dit semester zijn daar 4 cellijnen vanuit Barcelona (Hospital San Joan de Deu) bij gekomen. Ondertussen hebben wij zelf echter ook een aantal cellijnen gemaakt van patiëntenmateriaal. Eén van die cellijnen, VUMC-DIPG-08, hebben we genetisch gekarakteriseerd om te bevestigen dat het dezelfde afwijkingen bezit als de oorspronkelijke tumor. Dit bleek inderdaad zo te zijn en we kunnen deze cellen dus gebruiken voor verdere experimenten, zoals het uittesten van nieuwe therapieën.

–       Groeifactoren en hun bijbehorende signaaloverdrachtspaden zijn een mogelijk aangrijpingspunt voor dergelijke nieuwe behandelingen. Inmiddels zijn 16 doelgerichte medicijnen, elk met verschillende aangrijpingspunten, getest op 6 verschillende DIPG cellijnen (aangeduid als: VUMC-DIPG-A, SF7761, JHH-DIPG-01, SU-DIPG-VI, HSJD-DIPG-07 en VUMC-DIPG-08). Middelen gericht tegen traditionele groeifactor receptoren als VEGFR, PDGFR en EGFR (“Vascular Endothelial-“, “Platelet Derived-” en “Endothelial Growth Factor Receptor”) bleken grotendeels ineffectief. Uitzondering hierop is Canertinib, een EGFR remmer met een uniek profiel van secundaire doelwitten. Vijf andere, minder voor de hand liggende, medicijnen bleken echter wel effectief te zijn op DIPG: Marizomib (een proteasoom inhibitor), Trametinib (MEK inhibitor), Linsitinib (INSR/IGF1R inhibitor), R428 (AXL inhibitor) en OTSSP167 (MELK inhibitor). Deze middelen zullen wij de komende tijd nog verder onderzoeken.

–       Om te bepalen waarom bepaalde middelen niet effectief zijn in DIPG terwijl we dat op basis van literatuur wel zouden verwachten, hebben we gekeken naar de reactie van DIPG cellen op de gebruikte medicijnen. Dit hebben we gedaan middels zogenaamde “antibody arrays”, die ons in staat stellen om de activatie (fosforylatie) van enkele tientallen groeifactor-receptoren tegelijk te bepalen, alsmede de moleculaire signaaloverdracht die hierna in de cel plaatsvindt. Uit deze arrays bleek dat DIPG cellen een veelvoud aan groeifactoren kunnen gebruiken; sommige cellen hebben dusdanig veel overlevingsroutes geactiveerd dat het remmen van één signaaltransductiepad geen effect heeft, terwijl andere cellen die behandeld worden met een bepaald middel alternatieve overlevingsroutes aan kunnen schakelen. Bovendien bleek dat sommige paden, zoals de “Platelet Derived Growth Factor alpha” (PDGFRA) gestuurde signaaloverdracht, niet actief waren – en dus niet geschikt als aangrijpingspunt voor therapie – terwijl we dat op basis van de genetische profielen wel zouden verwachten. Tot dusver hebben we 3 cellijnen met antibody arrays getest. De komende tijd zullen ook de overige cellijnen op deze manier onderzocht worden.

–       Dankzij de antibody arrays hebben we meer inzicht gekregen in de onderliggende processen die de cel helpen te overleven. Zo blijken sommige DIPG cellen zelf groeifactoren te produceren en zo hun signaaltransductiepaden te reguleren. Gebruikmakend van deze resultaten kunnen we nu ook combinaties van (twee of meer) middelen gaan ontwerpen om te voorkomen dat cellen kunnen overschakelen op alternatieve overlevingsroutes. Deze opties zullen verder worden uitgediept.

–       Naast de groeifactoren zijn er andere mogelijke aangrijpingspunten voor therapie, zoals de zogenaamde epigenetische enzymen. Dit zijn eiwitten die de vouwing van DNA, en daarmee de werking van bepaalde genen, kunnen beïnvloeden. Omdat die vouwing in DIPG vaak verstoord lijkt, hebben we een groot panel van middelen getest die op verschillende manieren ingrijpen op deze vouwing. Een aantal van deze medicijnen bleek herhaaldelijk effectief; hier wordt momenteel verder onderzoek aan gedaan.

–       Zoals hierboven genoemd werd, bleek dat het middel Marizomib DIPG cellen in het laboratorium zeer effectief kon doden. Omdat we verwachten dat dit middel relatief makkelijk in de hersenstam zou kunnen komen, testen we dit middel momenteel in ons E98FM muismodel. Resultaten hiervan worden op korte termijn verwacht.

–       Een andere mogelijke behandeloptie die in muizen getoetst wordt, is het gebruik van het medicijn doxorubicine. Dit chemotherapeuticum gaf goede resultaten in onze laboratorium experimenten, maar omdat het in kinderen veel schadelijke bijwerkingen kan geven wanneer het via het bloed wordt toegediend en het waarschijnlijk moeilijk op de plaats van de tumor komt, zou het via convection enhanced delivery (CED) toegediend moeten worden. Bij CED wordt medicatie direct in de hersenstam ingespoten om zo de storende invloed van de bloed-hersen-barrière te omzeilen. Directe toediening van doxorubicine in de hersenstam lijkt echter veel schade aan te brengen in het normale weefsel en het valt nog te bezien of we een dosis doxorubicine kunnen vinden die hoog genoeg is om tumorgroei tegen te gaan, maar laag genoeg is om niet teveel bijwerkingen te geven.

–       Al onze huidige experimenten worden om praktische redenen nog steeds uitgevoerd op het E98 muismodel. Pogingen om tumoren te laten groeien uit materiaal dat afkomstig was van autopsie, leidden weliswaar tot een aantal diermodellen, maar bij nadere analyse bleken dit tot onze verrassing muizentumoren te zijn geworden, in plaats van echte menselijke DIPGs. Dit is inmiddels ook bij andere onderzoekscentra ontdekt. We zijn aan het analyseren waarom deze tumoren dit gedrag hebben vertoond. Na injecties van tumormateriaal van één van de meer recente autopsies is echter een ander muismodel ontstaan, waarvan we vermoeden dat het wèl uit menselijke DIPG cellen bestaat. We willen dit model echter eerst goed karakteriseren, voordat we met zekerheid kunnen zeggen dat het hier om een “menselijk DIPG muismodel” gaat.

–       Naast bovengenoemd diermodel uit autopsiemateriaal van één van onze eigen patiënten, willen we nieuwe muismodellen creëren uit een aantal van de door samenwerking verkregen cellijnen. Hiervoor moeten we deze cellijnen echter eerst uitrusten met het zogenaamde luciferase gen. Dit gen stelt ons in staat om tumorgroei in de tijd te volgen met behulp van een CCD camera, wanneer deze cellen in de hersenen worden geïmplanteerd. Ook deze experimenten zijn momenteel in volle gang.

–       Een belangrijke doorbraak in het DIPG onderzoek was de bevinding dat 70-80% DIPG patiënten een afwijking heeft in het DNA dat codeert voor het histon 3 gen. Veel onderzoeksgroepen richten zich nu op het ontwikkelen van nieuwe therapieën die zich specifiek richten op dit histon 3 gen. In de toekomst zal het derhalve belangrijk zijn om te weten of een DIPG patiënt al dan niet een dergelijke mutatie heeft, omdat de behandeling daarop kan worden afgestemd. Aangezien niet bij alle kinderen met DIPG een biopt van de tumor wordt genomen, zijn we een diagnostische test aan het ontwikkelen die ons in staat stelt om dergelijke mutaties aan te tonen in het bloed van patiënten. Op dit moment lijkt deze nieuwe methode gevoelig en specifiek genoeg om in patiënten toe te passen, maar we moeten deze techniek nog verder optimaliseren voordat de vertaalslag naar de kliniek gemaakt kan worden.

–      Bij volwassenen leidt behandeling van hoog-gradig glioom met het chemotherapeuticum Temozolomide (TMZ) tot meerdere maanden levensverlenging. Vanwege dit positieve resultaat zijn er ook bij kinderen en adolescenten met DIPG verscheidene klinische studies gedaan met TMZ en werd TMZ, naast bestraling, steeds meer gezien als een standaardbehandeling. Of er echte effecten zijn van TMZ op de overleving van kinderen met DIPG is echter nog onduidelijk. Daarom hebben wij in samenwerking met de Cochrane Collaboration, een wereldwijde non-profit organisatie van duizenden artsen, epidemiologen en statistici, alle gepubliceerde onderzoeken over het gebruik van TMZ bij kinderen structureel en gedetailleerd bekeken en samengevat. Het artikel waarin we dit onderzoek beschrijven, wordt in 2015 gepubliceerd.

 

Resultaten onderzoek, tijdvak januari-juli 2014

–          Vanaf 1 april 2014 is Hans Meel toegevoegd aan het team van onderzoekers als opvolger van Jolien Janzen.

–          Eén van de belangrijkste aandachtspunten van het onderzoek is nog steeds om diermodellen op te zetten waar nieuwe behandelingen voor DIPG op getest kunnen worden. De hiervoor gebruikte methodes worden voortdurend getoetst en verbeterd. Zo hebben we in de tweede helft van 2013 andere celkweekprotocollen in het laboratorium geïmplementeerd en hiermee zijn we er begin 2014 voor het eerst in geslaagd om DIPG cellen die afkomstig waren van een autopsie (VUMC-DIPG-08) in stamcelmedium te kweken. Hoewel dit proces nog zeer langzaam gaat, is dit een zeer belangrijke stap, omdat eerder onderzoek heeft aangetoond dat cellen die zo gekweekt zijn een grotere kans hebben om een tumor te vormen in de muis. Een aantal van deze cellen is ondertussen ingespoten in muizen; de overgebleven cellen worden momenteel vermeerderd zodat we genoeg materiaal hebben voor verder onderzoek.

–          Naast de optimalisatie van de kweekprotocollen en het opzetten van onze eigen cellijnen hebben we opnieuw cellen uitgewisseld met laboratoria in het buitenland. Zo hebben wij twee cellijnen uit het buitenland ontvangen, genaamd JHH-1 (Johns Hopkins, USA) en SU-DIPG-VI (Stanford, USA) en zijn er andersom ook VUMC lijnen zijn o.a. naar laboratoria in Heidelberg (Duitsland) en Pamplona (Spanje) gestuurd. Tumormateriaal van de laatste twee autopsies is bovendien naar Amerika verscheept voor DNA sequencing: het bepalen van afwijkingen in het DNA.

–          Uit ervaring blijkt dat cellijnen die verkregen zijn uit biopsie- of autopsie materiaal na enige tijd stoppen met delen, door een biologisch proces dat ‘senescence’ genoemd wordt. Om te voorkomen dat dit ook met de DIPG cellijnen gebeurt willen we de cellijnen uitrusten met een gen dat dit senescence proces voorkomt. Hiermee veranderen de cellen enigszins ten opzichte van de oorspronkelijke tumor, maar daar tegenover staat dat er meer materiaal is voor experimenten. Per experiment zal echter steeds bekeken worden welke cellen het beste gebruikt kunnen worden.

–          De cellijnen die momenteel in ons laboratorium aanwezig zijn, worden gebruikt voor het opzetten en uittesten van nieuwe therapieën. Eén van de mogelijke opties voor dergelijke nieuwe behandelingen richt zich op groeifactoren en hun bijbehorende signaaloverdrachtspaden. Om te onderzoeken of deze groeifactoren als aangrijpingspunt kunnen dienen voor therapie, hebben we een panel samengesteld van 11 nieuwe ‘doelgerichte’ medicijnen die elk een verschillende werking hebben en die mogelijk in combinatie gebruikt kunnen worden. Het effect van deze medicijnen op de cellen wordt op verschillende tijdspunten na behandeling bekeken, waarbij we niet alleen naar celgroei en celdood kijken, maar ook naar de onderliggende signaaloverdrachtspaden die tot deze processen kunnen leiden. Dit is vooral van belang omdat cellen die met dergelijke medicijnen behandeld worden vaak ‘overlevingsmechanismes’ inschakelen om te ontsnappen aan bepaalde behandelingen. Wanneer we weten welke overlevingspaden worden aangezet kunnen we die ook blokkeren en zo combinaties van medicijnen ontwikkelen om het beoogde resultaat te behalen.

–          Naast het uittesten van nieuwe behandelingen op cellijnen zijn ook de dierexperimenten in volle gang. Om te testen of bevacizumab – een middel dat gericht is tegen de VEGF groeifactor – na toediening via de bloedbaan ook daadwerkelijk in de tumor aankomt, hebben we dit gekoppeld aan een radioactief label (zirconium-89) dat door middel van een PET-scan getraceerd kan worden. Uit dergelijke scans bleek dat muizen met tumoren in de hersenstam of in de grote hersenen geen opname van bevacizumab vertoonden, terwijl het middel wel aankwam in tumoren die onder de huid van muizen werden gespoten. Om te onderzoeken of dit verschil veroorzaakt werd door de aanwezigheid van de bloed-hersen-barrière, of door een verschil in VEGF expressie, hebben we de aanwezigheid van VEGF in de tumoren onderzocht. Uit deze experimenten bleek dat de onderhuidse tumoren wel VEGF hebben, maar dat er in de tumoren in het brein geen VEGF aanwezig is. Toekomstige experimenten zullen uit moeten wijzen of de afwezigheid van VEGF te maken heeft met de locatie of het stadium van de tumor, of dat het omliggend weefsel hier eventueel een rol in kan spelen. Deze bevindingen zijn mogelijk van belang voor het al dan niet gebruiken van bevacizumab in toekomstige behandelingen; immers, als het middel niet in de tumor aankomt, of als het aangrijpingspunt niet aanwezig is, zal een behandeling niet effectief zijn. De resultaten van dit onderzoek zijn gepresenteerd op de ISPNO meeting in Singapore, eind juni 2014.

–          Andere experimenten die direct gericht zijn op vertaling naar de kliniek, zijn de proeven met convection enhanced delivery (CED), waarbij medicatie direct in de hersenstam wordt toegediend om zo de storende invloed van de bloed-hersen-barrière te omzeilen. Gebruik makend van CED in muizen testen we momenteel drie verschillende vormen van het medicijn doxorubicine, waarvan we een verschillende verspreiding en effectiviteit verwachten: ‘vrij’ doxorubicine, ‘liposomaal’ doxorubicine (waarbij het medicijn is verpakt in vetbolletjes) en de liposomaal doxorubicine waarbij aan het vetbolletje een glutathion-ion is toegevoegd. De eerste resultaten geven aan dat het direct inspuiten van doxorubicine in de hersenstam echter niet zonder gevaar is en dat de doseringen die gebruikt dienen te worden lager liggen dan verwacht. Inmiddels hebben we de hoogst mogelijke dosering voor alle drie de vormen vastgesteld en in de komende maanden zullen we deze doseringen gebruiken voor de therapiestudie in muizen.

–          Omdat genetische analyses van hebben aangetoond dat 70-80% DIPG patiënten een afwijking hebben in het DNA dat codeert voor het histon 3 gen, wordt er in het algemeen verondersteld dat deze mutatie van belang is voor het ontstaan van DIPG. Om dit te onderzoeken willen we gebruik maken van de zogenaamde CRISPR technologie; een nieuwe methode die ons in staat stelt om genen specifiek te veranderen. Met behulp van deze technologie kunnen we deze histon 3.3 mutatie in brengen in cellijnen die deze afwijking van nature niet bezitten, of herstellen in cellen die deze mutatie juist wel hebben. Hiermee kunnen we de invloed van histon 3 mutaties in detail bestuderen en bovendien onderzoeken of deze afwijking kan dienen als aangrijpingspunt voor nieuwe therapieën.

–          Zoals hierboven beschreven, is het in de toekomst mogelijk van belang om te weten of een DIPG patiënt al dan niet een mutatie heeft in het histon 3 gen. Omdat niet bij alle kinderen met DIPG een biopt van de tumor wordt genomen, zijn we een nieuwe methode aan het ontwikkelen om kleine hoeveelheden gemuteerd histon 3.3 aan te kunnen tonen in het bloed van patiënten. Op dit moment lijkt deze nieuwe methode veelbelovend en de komende tijd zullen wij deze techniek optimaliseren en uittesten in onze muismodellen.

–        Het artikel waarin we beschrijven dat er muizentumoren ontstaan na het injecteren van autopsie materiaal in de hersenstam is geaccepteerd voor publicatie in Acta Neuropathologica. In dit blad is ook een ander artikel verschenen dat we in samenwerking met Stanford University (USA) hebben geschreven over de pathologie van diffuus intrinsiek ponsglioom.

Resultaten onderzoek, tijdvak augustus-december 2013

–          Om een beter beeld te krijgen van de muismodellen die de laatste jaren in het laboratorium zijn ontwikkeld, zijn drie van deze modellen verder gekarakteriseerd. Hieruit blijkt dat belangrijke mutaties die aanwezig zijn in het DNA van DIPG patiënten, zoals een afwijking in het histon 3 gen, niet aanwezig zijn in onze muizen. Hoewel deze muizen wel andere belangrijke genetische afwijkingen blijken te hebben, is het doel nog steeds om diermodellen op te zetten de situatie in de patiënt zo precies mogelijk nabootsen. Daarom zijn protocollen uitgewisseld met andere laboratoria in Europa en Amerika die wel in staat lijken om DIPG cellen afkomstig van autopsie in diermodellen te transplanteren. De voorlopige resultaten met deze nieuwe protocollen zijn positief.

–          Om het aantal diermodellen waarmee gewerkt kan worden te vergroten, is bovendien contact gezocht met andere laboratoria voor het verkrijgen van nieuw patiëntenmateriaal. Het transport van dergelijk materiaal blijkt soms lastig, maar we hopen binnenkort cellen te krijgen van het “Centro Medico Nacional siglo XXI” (Mexico) en we hebben materiaal gekregen uit Portland (USA). Bovendien hebben we nu twee cellijnen van DIPG patiënten uit Californië in kweek: SU-DIPG-I-FlucGFP (Stanford) en SF7761hTertFluc (San Francisco). Deze cellen zijn ook in muizen ingespoten voor het opzetten van nieuwe diermodellen. De eerste cellijn (SU-DIPG-I) gaf geen bruikbaar diermodel; de andere cellen (SF7761) lijken echter in de hersenstam tot een tumor uit te groeien. Dit model kan dus gebruikt worden voor het testen van nieuwe therapieën.

–          Naast materiaal uit het buitenland, werken we ook met materiaal dat wij zelf van Nederlandse patiënten verkregen hebben. In 2013 hebben we daarmee twee nieuwe cellijnen ontwikkeld: een cellijn die afkomstig van een oorspronkelijke ponstumor en een cellijn die afkomstig is van een uitzaaiing van dezelfde patiënt. Beide cellijnen groeien goed, maar bleken bij nader onderzoek geen genetische afwijkingen te vertonen. Waarschijnlijk zijn in dit geval dus niet de kankercellen uitgegroeid, maar hebben we de “gezonde” hersencellen die zich nog in de tumor bevonden gekweekt. Deze cellen zijn van grote waarde voor onze laboratoriumexperimenten, maar zullen niet gebruikt worden voor het opzetten van nieuwe muismodellen voor DIPG.

–          Twee andere cellijnen die aanwezig zijn in ons laboratorium, VUMC-DIPG-A en VUMC-DIPG-B, blijken ook na nadere analyse wèl echte DIPG cellen te zijn, met een afwijking in het eerder genoemde histon 3 gen. De gevoeligheid van deze cellen voor een groot aantal medicijnen is in het laboratorium getest, met hoopgevende resultaten.

–          Genetische analyses geven aan dat de histon 3 afwijking bij 70-80% DIPG patiënten voorkomt. Door deze mutatie wordt het DNA van DIPG patiënten anders in een cel wordt opgevouwen dan bij gezonde kinderen. Dat kan nadelige gevolgen hebben (zoals tumorgroei), maar dat kan er ook toe leiden dat deze cellen gevoeliger worden voor chemotherapeutische middelen die aangrijpen op het DNA, zoals anthracyclines. VUMC-DIPG-A, een DIPG cellijn met een histon 3 mutatie, bleek in onze experimenten inderdaad erg gevoelig voor de anthracycline doxorubicine. Dit middel zal binnenkort ook in onze muismodellen worden getest.

–          Voor cellen die geen afwijking hebben in het histon 3 gen kan de vouwing van DNA ook door toediening van chemische middelen, zoals de zogenaamde “HDAC inhibitors”, worden beïnvloed. Zo hebben we aangetoond dat cellen gevoeliger worden voor anthracyclines als we dit met HDAC inhibitors combineren. We willen nu testen of een dergelijke combinatie van medicijnen elkaar ook nog kan versterken in cellen met een histon 3 mutatie.

–          Zoals hierboven aangegeven, willen we het effect van doxorubicine uittesten in onze muismodellen, eventueel in combinatie met HDAC inhibitors. Omdat doxorubicine echter veel toxiciteit geeft in andere organen en mogelijk niet over de bloed-hersen barrière komt, willen we dit toepassen middels Convection Enhanced Delivery (CED). Dit is een methode waarbij medicijnen direct in de tumor toegediend worden en waarbij zo de bloed-hersen barrière vermeden wordt. In het laboratorium hebben we al laten zien dat CED met het chemotherapeuticum carmustine veilig en effectief is in muizen met een E98FM-DIPG tumor in de hersenstam. Om de therapie nog verder te verbeteren willen we nu doxorubicine toedienen in de vorm van vetbolletjes (nanopartikels). Van deze vetbolletjes is aangetoond dat ze een betere spreiding geven in de tumor na toediening via CED en verwachten we dus een effectievere therapie.

–          Bij de behandeling van kinderen met een hersentumor – en DIPG in het bijzonder – lijkt de afgifte van medicijnen op de plaats van bestemming nog altijd één van de knelpunten te zijn. Naast het gebruik van CED, zijn we daarom ook andere manieren aan het ontwikkelen om medicijnen over de bloed-hersen barrière te krijgen. Hiervoor zijn we een samenwerking gestart met To-BBB, een bedrijf dat zich specialiseert in het ontwijken van deze bloed-hersen barrière. In de komende maanden zullen we nieuwe middelen testen in muismodellen om de vertaalslag te kunnen maken naar het behandelen van kinderen met DIPG.

–          Van 6 Nederlandse DIPG patiënten is het DNA uitgelezen om genetische afwijkingen te detecteren, waarbij zowel gekeken is naar aangeboren-, als naar tumor-specifieke afwijkingen. Na nieuwe analyses blijkt daarbij dat de tumoren niet zoveel mutaties bevatten als oorspronkelijk gedacht. Het aantal afwijkingen dat in de tumoren van onze DIPG patiënten is gevonden varieert van 18 tot 100. Om te bepalen hoe belangrijk deze mutaties zijn voor het ontstaan van DIPG hebben we toegang gevraagd tot de database van het St Jude Children’s Research Hospital in Memphis (USA) waarin de mutaties zijn geanalyseerd van maar liefst 50 DIPG patiënten. Door grotere aantallen patiënten te analyseren, hopen we eerder te kunnen onderscheiden welke afwijkingen al dan niet van belang zijn voor DIPG.

–          Van alle gevonden mutaties in DIPG, hebben we momenteel 8 verschillende afwijkingen bevestigd. Een aantal van deze afwijkingen zijn gevonden in genen die betrokken zijn bij signaaltransductie, het proces waarbij signalen uit de omgeving van een cel worden omgezet in een respons binnen de cel. Andere afwijkingen vinden we in genen die betrokken zijn bij het herstellen van DNA schade, zoals het p53 gen of BRCA2. Op basis van deze resultaten verwachten we dat chemotherapeutica die DNA schade kunnen induceren erg effectief zijn in DIPG; immers, wanneer tumorcellen hun schade niet kunnen herstellen zullen ze dood gaan. De eerder genoemde anthracyclines behoren tot de chemotherapeutica die aangrijpen op DNA, wat een extra argument is om doxorubicine te testen voor de behandeling van DIPG.

Resultaten onderzoek, tijdvak januari-juli 2013

Van 7 t/m 9 maart heeft VUmc in samenwerking met de Koninklijke Nederlandse Academie van Wetenschappen (KNAW) een colloquium georganiseerd over DIPG, om kennis over deze ziekte te delen en de laatste ontwikkelingen in het onderzoek te bespreken. Hiervoor zijn enkele experts uit binnen- en buitenland uitgenodigd, wat o.a. mogelijk werd gemaakt door een toelage van het KNAW. Op de eerste dag werd de biologie van DIPG tumoren besproken, terwijl op de tweede dag de klinische aspecten (mogelijke nieuwe behandelingen) de revue passeerden. Op de derde dag volgde tenslotte een masterclass om jonge onderzoekers de gelegenheid te geven over hun werk te vertellen.

Laboratorium onderzoek:
–    Na injectie van menselijke tumorcellen – afkomstig van autopsie – ontstaan er hersenstamtumoren in onze muismodellen die qua uiterlijk lijken op de menselijke DIPGs, maar die bij nader onderzoek uit muizencellen blijken te bestaan. In de afgelopen maanden hebben we deze muizentumoren beter in kaart gebracht en ontdekt dat de genetische afwijkingen in de muizentumoren in belangrijke mate verschillen van de afwijkingen die we in menselijke DIPGs vinden. Hoewel deze modellen hun eigen voordelen hebben, is dit niet optimaal als we nieuwe patiënt-specifieke therapieën willen testen. Daarom wordt er nog steeds hard gewerkt om een menselijk DIPG modelsysteem in muizen te creëren.
–    Eén van de manieren waarop we onze procedures proberen te verbeteren is door contact op te nemen met verschillende laboratoria in Europa en Amerika die wel in staat lijken om DIPG cellen afkomstig van autopsie in diermodellen te transplanteren. Door de gebruikte protocollen te vergelijken en onze eigen protocollen voor het verwerken van DIPG autopsiemateriaal te optimaliseren, willen we de kans op succes vergroten en zelf nieuwe DIPG modellen opzetten. Bij een volgende autopsie zullen daartoe meerdere methodes naast elkaar gebruikt gaan worden. Bovendien hebben we materiaal uitgewisseld met Stanford (USA) om te bepalen waar het probleem zit: in het materiaal of de procedures. Stanford zal ons celmateriaal dus inspuiten in hun muizen, terwijl wij hun cellen hebben opgekweekt en hebben geïnjecteerd in onze muizen. We kijken nu of deze zullen uitgroeien tot een menselijke DIPG tumor.
–    Naast het opzetten van muismodellen wordt autopsie materiaal ook gebruikt om cellijnen te ontwikkelen. Het afgelopen half jaar zijn we in staat geweest om een goed groeiende cellijn te isoleren vanuit een ponstumor en vanuit een uitzaaiing van deze ponstumor. Deze cellen hebben we gekarakteriseerd met behulp van karyotypering (chromosoomonderzoek), groeicurves en eiwitkleuringen. Ook hebben we de cellen in de tijd gefilmd om te onderzoeken hoe deze cellen zich in vitro (in kweek) bewegen. Hieruit bleek dat vooral de cellen die vanuit de pons geïsoleerd zijn, erg beweeglijk zijn. Wat hiervan de betekenis is en of we die beweging kunnen tegengaan moet nog verder onderzocht worden. Naast deze laboratoriumproeven zijn deze cellen ook gebruikt voor het opzetten van een DIPG diermodel, maar na injectie van deze cellen in muizen groeiden er geen tumoren uit. Wel kunnen de cellen verder gebruikt worden voor het testen van nieuwe medicijnen in het laboratorium.
–    De gevoeligheid van eerder ontwikkelde cellijnen (VUMC-DIPG-A, -B en -1) voor verschillende medicijnen is reeds in het laboratorium getest. Hieruit bleek dat DIPG cellen buiten het lichaam wel degelijk gevoelig zijn voor chemotherapie en dan met name voor de ‘klassieke’ middelen zoals doxorubicine en mitoxantrone. Deze resultaten zijn, samen met de resultaten van andere hooggradige gliomen, gepubliceerd in PLoS ONE (Veringa et al., 2013). Op basis van deze resultaten zal het gebruik van doxorubicine in de behandeling van DIPG nu verder onderzocht worden.
–    Naast bovengenoemde studie is de gevoeligheid van VUMC-DIPG-A en -B nog op een breder panel medicijnen getest in het kader van een internationale samenwerking met de “Cure starts now Foundation”. Bij dit project zijn naast onze cellijnen nog 8 DIPG lijnen uit verschillende laboratoria getest. Uit deze experimenten bleek dat de WEE1 inhibitor (MK-1775) mogelijk een goed middel te zijn als therapie tegen DIPG. Aangezien wij al aan MK-1775 gewerkt hebben (artikel in Februari 2013 geaccepteerd in Molecular Cancer Therapy), hebben we voorgesteld dat wij hier verdere (dier)proeven aan doen. Een voorstel voor financiering hiervoor ligt bij de “Cure starts now foundation”. Hierbij zal o.a. gekeken worden naar het gebruik van andere middelen in combinatie met MK-1775, of naar het gebruik van WEE1 inhibitor wanneer proefdieren niet eenmalig, maar meerdere keren bestraald worden (zoals dat in de praktijk ook bij patiënten gebeurt). Bovendien start in Amerika een klinische trial met WEE1 inhibitor die mede gebaseerd is op onze resultaten.
–    In de huidige experimenten worden muizen met een DIPG tumor om praktische redenen eenmalig bestraald. In samenwerking met de technische dienst van de VU hebben we een hulpmiddel ontwikkeld dat het mogelijk maakt om muizen herhaaldelijk onder verdoving te kunnen bestralen. In de komende maanden zullen we deze methode testen, zowel in combinatie met MK-1775, maar ook in combinatie met dexamethason.
–    Het genetische materiaal van 5 Nederlandse DIPG patiënten is geanalyseerd en onderzocht op mutaties die een rol kunnen spelen bij het tot stand komen van de tumor (“DNA sequencing”). Hierbij is zowel gekeken naar afwijkingen in de tumor ten opzichte van het normale weefsel van dezelfde patiënt (tumor-specifieke afwijkingen), als naar verschillen tussen het normale weefsel van DIPG patiënten ten opzichte van gezonde personen om eventuele aangeboren afwijkingen te vinden. Gemiddeld zijn er daarbij ongeveer 500 afwijkingen (mutaties) gevonden in de tumoren (waarvan 281 in meer dan 1 patiënt) en ongeveer 300 aangeboren afwijkingen per patiënt. Om iets over deze mutaties te kunnen zeggen, moeten ze echter eerst nog in het laboratorium bevestigd worden wat in de praktijk vaak lastig blijkt. Tot nu toe is er echter slechts 1 aangeboren mutatie in het zogenaamde p53 gen bevestigd in 1 patiënt. Dit gen is betrokken bij het herstel van DNA schade en kan dus een rol hebben gespeeld in het ontstaan van de tumor, maar aangezien de andere 4 patiënten deze afwijking niet hebben, lijkt het niet aannemelijk dat dit de oorzaak is van DIPG.
–    Naast het p53 gen zijn is in het tumor DNA van deze patiënt ook een mutatie gevonden die niet aanwezig is in het DNA van normale cellen: BRCA2, ook een eiwit dat betrokken is bij herstel van DNA schade, heeft in de tumor het aminozuur lysine vervangen voor een glutamine. Omdat ook BRCA2 in slechts 1 patiënt gemuteerd blijkt te zijn, moet nog onderzocht worden wat de betekenis hiervan is. Dat een aminozuurverandering echter grote gevolgen kan hebben, blijkt uit de mutatie die gevonden is in het histon eiwit 3.3. Daar is een lysine veranderd in een methionine, waardoor de hele cel ontregeld wordt. Deze afwijking hebben we nu aangetoond in 3 van de 5 patiënten, alsmede in 2 patiënten waarvan wel tumormateriaal is afgenomen, maar die nog niet geheel gesequenced zijn. Ook bleek deze afwijking aanwezig te zijn in zowel de oorspronkelijke ponstumor als in een uitzaaiing in de grote hersenen.

Resultaten onderzoek, tijdvak juli-december 2012

– Er is een nieuwe promovendus aangesteld als opvolgster voor Viola Caretti: Jolien Janzen. Jolien zal op 1 januari 2013 beginnen.

– Eerder hadden we al gemeld dat er muizentumoren zijn ontstaan na injectie van menselijke tumorcellen afkomstig van autopsie. Dit gebeurde in alle 3 de gevallen. Ondertussen zijn er ook tumoren gaan groeien uit het materiaal van een 4e DIPG patiënt. Deze tumoren konden succesvol in muizen worden getransplanteerd, zowel onderhuids als intracranieel, maar wederom bleek het hier om een muizentumor te gaan (bevestigd met muis- of mens-specifieke kleuringen). Dit DNA èn het DNA van de andere muizentumoren is gesequenced in Heidelberg. Over de genetische achtergrond van deze tumoren is echter nog geen uitsluitsel te geven, aangezien dit weefsel – anders dan aanvankelijk gedacht – toch ook nog menselijke cellen blijkt te bevatten, wat analyses bemoeilijkt.

– Om uit te sluiten dat er in ons laboratorium iets ‘rondwaart’ wat het onstaan van muizentumoren induceert, is er met het Medisch Centrum St Radboud in Nijmegen overlegd of de muizenexperimenten bij een volgende autopsie eventueel in Nijmegen uitgevoerd kon worden. Helaas bleek dat door alle bureaucratie op korte termijn niet haalbaar. Besloten is nu om andere factoren te gaan varieren, om te kijken of dat invloed heeft op het ontstaan van tumoren.

– Hoewel er geen laboratorium experimenten in Nijmegen kunnen worden uitgevoerd is er ondertussen wel een vernieuwde versie geschreven van het autopsie protocol om het Medisch Centrum St Radboud bij nieuwe autopsies te kunnen betrekken. Met veel gemengde gevoelens kon dit protocol eind November in de praktijk worden gebracht en heeft een autopsie plaatsgevonden in Nijmegen. Hierbij is tumormateriaal en gezond hersenweefsel verzameld voor verschillende doeleinden. Tumorweefsel van drie verschillende plaatsen in de hersenen is volgens protocol verwerkt ten behoeve van celkweek. Daarnaast is het tumormateriaal van twee van de drie plaatsen direct geïnjecteerd bij in totaal 18 muizen. Van alle tumorlocaties en diverse tumor-vrije gebieden is materiaal ingevroren voor DNA- en RNA isolatie. Bovendien is, zoals gebruikelijk, tumor materiaal gefixeerd in formaldehyde voor het stellen van de definitieve histologische diagnose.

– Naast het inspuiten van tumorweefsel afkomstig van biopsie of autopsie, gebruiken verschillende onderzoeksgroepen in het laboratorium gekweekte tumorcellen voor het opzetten van DIPG muismodellen. Zo heeft een onderzoeksgroep uit San Francisco cellen geisoleerd uit een laaggradige hersenstamtumor en die vervolgens in het laboratorium zo veranderd dat ze continu blijven delen. Wanneer deze cellen worden ingespoten in de muis onstaat een hersenstamtumor. Momenteel proberen wij om van deze cellen ook in ons laboratorium een experimenteel DIPG muismodel te maken, zodat we onze nieuwe behandelingen op meerdere modellen kunnen uittesten.

– Het E98 DIPG model is gebruikt om IL4-PE te testen als mogelijke behandelmethode voor hersenstamtumoren. Zoals eerder vermeld waren de eerste resultaten met dit toxine (Pseudomonas Exotoxine) weinig hoopgevend: net als de muizen die alleen met een placebo werden behandeld, overleden de met IL4-PE behandelde dieren zeer snel na CED. Een verklaring hiervoor zou kunnen zijn dat de tumoren al te groot waren bij de start van de behandeling, of dat er spraken was van toxiciteit van IL4-PE. Daarom hebben we besloten een lagere dosering toxine aan te houden (6 ug/ml en 18 ug/ml) en eerder te beginnen met behandelen. Helaas vonden we ook bij dit experiment geen verschil in overleving tussen de wel- en niet-behandelde groep. Om een verklaring te vinden voor dit tegenvallende resultaat, hebben we IL4-PE ook in het laboratorium getest op twee types glioomcellen: E98 en U251. In beide celtypes zagen we minder celdood dan verwacht. In de U251 cellen zagen we zelfs dat het door ons gebruikte IL4-PE een factor 50 minder effectief was dan eerder beschreven in artikelen. Mogelijk is er iets mis gegaan bij het verschepen van het IL4-PE uit Amerika. De onderzoeksgroep van dr Raj Puri, van wie we IL4-PE hebben gekregen, zal nu opnieuw naar de effectiviteit kijken voordat wij nieuwe muizenexperimenten uitvoeren.

– In het kader van een internationale samenwerking met de “Cure starts now Foundation” is een drugscreen uigevoerd waarbij de gevoeligheid van de cellijn VUMC-DIPG-A getest is voor 60 verschillende middelen. Hieruit blijkt dat vooral remmers van het zogenaamde PDGF (Platelet-derived growth factor) signaleringspad effectief blijken te werken op deze cellijn. Deze resultaten zullen worden vergeleken met de resultaten uit andere laboratoria en eventueel in muismodellen worden getest. Bovendien zal de drugscreen worden uitgebreid met een nieuw panel van medicijnen.

– Op 7, 8 en 9 maart zal er wederom een internationale DIPG meeting worden georganiseerd in Amsterdam. Hiervoor heeft het VU Medisch Centrum een prestigieuze grant toegewezen gekregen van de Koninklijke Nederlandse Academie van Wetenschappen (KNAW). Het symposium mag hierbij gebruik maken van de faciliteiten van de KNAW (het Trippenhuis).

Resultaten onderzoek, tijdvak januari-juli 2012

– Per 1 april 2012 is een nieuwe promovendus aangesteld op DIPG onderzoek: Lot Sewing. De vacature voor opvolging van Viola Caretti staat uit.
– De tumoren die ontstaan zijn na injectie van autopsiemateriaal in de experimentele muismodellen blijken muizentumoren te zijn, hoewel er menselijke cellen zijn geïnjecteerd. Deze bevinding is bevestigd door middel van muis- of mens- specifieke kleuringen en door controle van het DNA in de tumorcellen. Vooralsnog is niet duidelijk hoe dit komt, maar om meer inzicht te krijgen in deze (muizen)tumoren zal het DNA worden gesequenced in samenwerking met Heidelberg (groep Stefan Pfister). Hoewel het de bedoeling is om nieuwe diermodellen op te zetten met menselijke tumoren, zijn ook deze muismodellen een waardevolle toevoeging op het E98 model en de eerste experimenten waarin deze muizen zijn gebruikt zijn uitgevoerd in het kader van het CED-carmustine project (artikel ligt ter beoordeling bij “Cancer Discovery”).
Na de overtuigende experimenten op cellen en in proefdieren in dit project is er besloten om carmustine via CED ook in de kliniek te onderzoeken als therapie bij kinderen met een ponsglioom. Voordat het CED protocol ingediend kan worden bij de ethische commissie moet er echter nog één aanvullend dierexperiment gedaan worden. Carmustine is namelijk opgelost in alcohol en er moet in proefdieren gekeken worden of de alcohol niet teveel toxiciteit geeft wanneer het ingespoten wordt in de hersenstam.
– Naast CED met carmustine is ook IL4-PE als mogelijke behandeling in CED getest. IL4-PE is een toxine (Pseudomonas Exotoxine) dat specifiek om tumorcellen werkt die de Interleukine-4 receptor tot expressie brengen. Specifieke kleuringen tonen aan dat deze receptor, het aangrijpingspunt voor dit medicijn, inderdaad op een groot deel van de ponsgliomen en op E98 cellen aanwezig is (samenwerking met Dr Raj Puri, NIH, USA). Helaas zijn de eerste resultaten weinig hoopgevend, aangezien er geen verschil in overleving was tussen behandelde- en niet-behandelde muizen. Vervolgexperimenten met andere doseringen IL4-PE volgen.
– Net als in de kliniek zijn ook in het laboratorium experimenten gestart met gelabeld bevacizumab om de distributie van deze stof in muizen met DIPG te bestuderen op verschillende tijdstippen na toediening. We kunnen bij deze muizen ook kijken of de distributie van het medicijn verschilt indien de tumor op verschillende plaatsen in het lichaam zit (verschillende plaatsen in de hersenen of onderhuids). We kunnen zo uitvinden of medicijnen meer moeite hebben een glioom in de hersenstam bereiken dan elders in het lichaam. Deze resultaten zullen door Marc Jansen in een artikel worden gepubliceerd.
– Het artikel over het gebruik van de WEE1-remmer MK1775 voor DIPG ligt ter beoordeling bij “Molecular Cancer Therapeutics” (Viola Caretti).
– Sequencing: het totale DNA van 5 DIPG patiënten is gesequenced bij Complete Genomics om zo meer inzicht te krijgen in de mutaties die een rol kunnen spelen bij het ontstaan van de tumor. In 3 van de 5 patiënten blijkt een belangrijk eiwit dat betrokken is bij de regulatie van genexpressie (het zogenaamde histon H3 eiwit) gemuteerd te zijn. Helaas is dat begin dit jaar ook al door een Amerikaanse groep beschreven (St Jude’s: Nature Genetics). Dit lijkt echter niet de enige belangrijke mutatie te zijn en verdere analyses (i.s.m. de groep van Prof van der Spek – ErasmusMC) zijn in volle gang.
– Eind februari is er een Europese DIPG meeting geweest in Barcelona, waar het Europese DIPG netwerk bijeen kwam. Deze meeting is voortgezet in Toronto in de dagen voor het internationale congres over hersentumoren bij kinderen (ISPNO). Hoewel voortgang over het algemeen nog steeds langzaam gaat, gaan steeds meer groepen zich richten op onderzoek naar DIPG. Geprobeerd wordt om dit zoveel mogelijk in samenwerkingsverband te doen, zodat er voldoende materiaal is om mee te werken.
– Eén van de belangrijkste samenwerkingsverbanden buiten het Europese DIPG netwerk is de samenwerking met de “Cure starts now foundation”. In dit samenwerkingsverband wordt geprobeerd om in verschillende laboratoria – maar onder dezelfde omstandigheden – te testen of DIPG cellen gevoelig zijn voor verschillende medicijnen. Hierbij worden drugsplaten met 60 verschillende middelen uitgestuurd naar de deelnemende laboratoria, zodat een ieder onder dezelfde omstandigheden dezelfde middelen kan testen zonder daarvoor zijn ‘kostbare’ cellen uit handen te hoeven geven. Namens het VUmc zal de cellijn VUMC-DIPG-A getest worden en, indien genoeg cellen aanwezig zijn, ook VUMC-DIPG-B. Momenteel ligt de nadruk echter nog op het optimaliseren van de experimenten.

Resultaten onderzoek, tijdvak augustus 2011 – december 2011

– Experimenten muismodel gaan door. Er zijn verrassende resultaten die wij helaas nog niet openbaar kunnen maken. Nog even geduld.
– CED met Carmustine is toegepast op het VU-DIPG-muismodel en ook daar was van een  significant langere overlevingsduur sprake bij de muizen die behandeld werden met Curmustine dan de muizen die geen middel kregen toegediend.
– WEE1 inhibition oftewel de stof MK 1775. De experimenten zijn ook hiermee doorgegaan en hoewel er een verschil was tussen behandelde en niet-behandelende muizen was het verschil niet echt groot. Dit kan liggen aan het feit dat er meer keren bestraald had moeten worden (en niet 1 keer) of, omdat het de eerste keer was dat deze stof gebruikt werd bij hersenkanker, de bloed-hersen-barrière  kan een rol gespeeld hebben. Verder onderzoek zal nodig zijn.
– VUmc heeft een grant gekregen van Complete Genomics voor het sequencen van DIPG patienten materiaal (US $ 80.000,-). Dit houdt in dat we van 4 patiënten de gehele DNA sequentie op kunnen helderen (dus ook DNA dat niet direct codeert voor een gen/eiwit). Dit wordt zowel op tumor materiaal als op normaal weefsel van dezelfde patiënt gedaan, zodat er makkelijker vergeleken kan worden wat de verschillen zijn. Op deze manier hoopt men meer inzicht te krijgen in de mutaties die een rol kunnen spelen bij het tot stand komen van de tumor. Bovendien kan het normale DNA van de patiënten vergeleken worden met een databank van normaal DNA, om te zien of deze patiënten misschien een bepaalde aanleg hadden voor het krijgen van een tumor (bijvoorbeeld een mutatie in een gen). Het feit dat men de gehele DNA sequentie gaat ophelderen is in dit opzicht belangrijk. De meeste studies gaan uit van zogenaamd “exon-sequencing”, waarbij alleen het coderende gedeelte van het DNA wordt opgehelderd (~1.5% van ons totale genoom). Niet-gepubliceerde studies van Prof. van der Spek (ErasmusMC) hebben aangetoond dat vooral bij verschillende vormen van kinderkanker er mutaties zijn in niet-coderende stukken DNA. Bovendien blijken deze mutaties bij verschillende types kinderkanker overeen te komen. Prof. van der Spek zal het team van VUmc bijstaan in het analyseren van de data. Dit zal enige tijd vergen, omdat ons genoom bestaat uit ongeveer 3 miljard baseparen (zeg maar de bouwstenen van het DNA) die per sample ongeveer 40x-80x gelezen worden. Uitwerking van deze resultaten zal niet alleen veel tijd vergen doordat er grote hoeveelheden data geanalyseerd moeten worden, maar ook omdat Complete Genomics aangegeven heeft achter te lopen in de planning. Vooralsnog wordt de eerste sequencing data pas in april 2012 verwacht. Onze onderzoekster Esther Hulleman is hierover in onderhandeling en er lijkt een mogelijkheid om in ieder geval vast met 1 patiënt te beginnen, zodat VUmc ook zelf bekend kan raken met de programma’s die nodig zijn om de data te analyseren. Complete Genomics staat hier welwillend tegenover, mede omdat we naast de 8 samples uit de grant hebben besloten om 2 extra samples (1x tumor + 1x normaal) in te sturen die we vanuit het onderzoeksfonds zelf betalen. Op het moment van uitvoering had VUmc namelijk materiaal van 5 DIPG patiënten en er is voor gekozen het panel “compleet” te maken, omdat dit meer informatie op kan leveren wanneer men alle patiënten met elkaar kan vergelijken.
– In het laboratorium is begonnen met experimenten met gelabeld bevacizumab en nimotuzumab om de distributie te onderzoeken in proefdieren met een DIPG. We kunnen bij deze muizen ook kijken of de distributie van het medicijn verschilt indien de tumor op verschillende plaatsen in het lichaam zit. We kunnen zo uitvinden of medicijnen meer moeite hebben een glioom in de hersenstam bereiken dan elders in het lichaam.

Resultaten onderzoek, tijdvak januari 2011 – juli 2011

– Alle drie de injecties van DIPG cellen direct in de muizen zijn uitgegroeid tot DIPG tumoren. ER IS EEN MUISMODEL VAN DIPG CELLEN!!!!! Alle tumoren gingen groeien in de pons, en niet op de twee andere plaatsen die geïnjecteerd werden. Wederom een indicatie dat de micro-omgeving van de pons een grote rol speelt. Vervolgens werden de tumoren weer geïnjecteerd in naaktmuizen (zijn goedkoper dan SCID) en ook daar groeiden ze. Een tumor gedeelte is ook geïmplanteerd in andere delen van de muis om hopelijk grotere tumoren te kweken die nodig zijn voor andere experimenten.
– Carmustine gaf in ratten geen problemen. CED op muizen is nog niet eerder toegepast, waarschijnlijk omdat ze kleine hersenen hebben. Eerst weer met een transportmedicijn maar na een uur kwam de muis in neurologische problemen. Vervolgens met een half uur geprobeerd en dat ging goed. Carmustine gaf via CED ook geen problemen. E98 DIPG muismodel gebruikt. Twee groepen, 1 groep kreeg Carmustine, de ander alleen glucose. Er bleek een significante afname in tumor groei te zijn! Experiment wordt nu herhaald met DIPG muismodel.
– Experimenten met WEE1 inhibition zijn doorgegaan, gebleken is dat met de hogere dosis chemo (MK1775) er wel een effect is.
– Gebleken is dat de cellijn VUmc-DIPG-001 (voorheen VU248) andere winsten/verliezen in DNA heeft op verschillende plekken in het brein (pons, kleine hersenen en frontale kwab). Gaan nu ook bij de nadere vier lijnen kijken. Zal een indicatie geven of de biologie van de tumoren verandert als een tumor uitzaait. Ook zijn er verschillende tumorgraden gevonden op de dezelfde plek!
– De gevoeligheid van DIPG cellen voor verschillende chemotherapeutica is in het laboratorium getest. Uit deze experimenten blijkt dat er grote verschillen bestaan in de drugsgevoeligheid van de gekweekte DIPG cellen. Duidelijk is echter ook dat deze cellen doodgaan bij behandeling met Doxorubicine, mitoxantron, melfalan, vandetanib en carmustine. Momenteel is men aan het uitzoeken waarom DIPG cellen in de kweek blijkbaar wel reageren op een medicijnbehandeling terwijl dat in patiënten niet het geval lijkt te zijn.

Resultaten onderzoek, tijdvak augustus 2010 – december 2010

– Resultaten bestralingsstudie eerste halfjaar van 2010 worden bekend. De muizen zijn bestraald met verschillende dosissen van 2, 6 en 10 Gy per dag. Alle muizen zijn uiteindelijk doodgegaan maar door de bestraling was er wel een tijdelijke regressie. Hiermee is bevestigd dat het E98 DIPG muismodel hetzelfde reageert als een DIPG tumor in een kind. Nu zal er verder gezocht moeten worden met het muismodel naar hoe we de tumor gevoeliger kunnen maken voor bestraling.
– Test op het E98 DIPG muismodel (officieel E98-Fluc-mCherry) met 6Gy bestraling met 2 verschillende medicijnen MK1775 en PDO166285. Dit in het kader van WEE1 inhibition. Er blijkt geen effect te zijn. Misschien komt dit door een lage dosis medicijnen, of verkeerde stralingshoeveelheden. Experiment volgend halfjaar herhalen met wisselende dosissen.
– Getest of het E98 model net als DIPG cellen overexpressie hebben van PDGFR∂ en dat bleek zo te zijn.
– Glut-1: een markering die aantoont dat de bloed-hersen- barrière in tact is werd gevonden bij zowel het E98 DIPG muismodel als bij de obducties. Meer onderzoek naar de rol van deze is dus noodzakelijk.
– Karaterisering van de DIPG cellijnen die er nu zijn op gebied van: histologie, winsten/verliezen DNA inhoud (CGH analyse) en ‘gene expression profiling’. Bij 1 autopsie ook cellen van de frontale kwab weggenomen nu analyseren of daar ook verschillen in zitten: is het de tumorcel of de locatie die het verschil maakt.
– Injectie van menselijke DIPG cellen via het lab in de muizen heeft nog niet geleid tot een DIPG muismodel. Muizensoort is nu veranderd van naaktmuizen naar SCID muizen (nog lager immuunsysteem) en cellen gaan vanaf nu rechtstreeks geïnjecteerd worden en dan op 3 plekken in de hersenen (dus niet alleen de pons).
– CED in de hersenstam bij ratten. Eerst een transport drug bij een gezonde rat om te kijken of de hartslag en ademhaling goed bleef. Daarna carmustine toegediend, ging ook goed. Volgende stap is CED in het E98 DIPG muismodel. Bedoeling is dat de muizen eerst bestraald worden dan afwachten tot er groei is en dan CED toepassen.

Resultaten onderzoek, tijdvak januari 2010 – juli 2010

– Middels het E98 DIPG muismodel met medicijnen zoeken naar het bestralingsgevoeliger maken van DIPG cellen;
– Middels aankleuring enkele en groepen DIPG cellen identificeren in de pons van de muis.
– Vergelijke van de karakteristieken van het E98 DIPG muismodel met een echte DIPG tumor. Blijkt dat ze volledig op elkaar aansluiten.
– Als de E98 tumor eerst in de flank van de muis groeit en dan geïnjecteerd wordt in de pons volgt een diffuus groeipatroon, wordt de tumor eerst gekweekt in het lab en dan geïnjecteerd volgt een focale tumor.
– Vijftien muizen met E98 DIPG tumoren in de pons kregen straling toegediend.
– WEE1 is een ‘kinase enzyme’ die oververtegenwoordigd is in een DIPG cel (en gelukkig ook in het E98 muismodel). Omdat bestraling de enige methode tot op heden is die enig resultaat geeft, gaat men proberen om de cellen gevoeliger te maken voor bestraling door medicijnen toe te dienen die zich richten op tegengaan van WEE1, dat heet WEE1 inhibition. WEE1 inhibition doodt gliomacellen in vitro en in volwassen glioma cellen. Wordt nu getest op DIPG cellijnen en op het E98 DIPG muis model.
– DIPG cellen zijn geïnjecteerd in de pons van muizen nu afwachten.